Значительный рост интереса к цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) наблюдается в последние годы в связи с проблемами ВИЧ-инфекции, трансплантации органов и тканей человека, ухудшения качества окружающей среды, приводящего к нарушениям системы иммунитета, поскольку ЦМВИ обычно сопровождает иммунодефицитные состояния.
Цитомегаловирус (ЦМВ) относится к семейству Herpes viridae (род Cytomegalovirus). Отличительными особенностями ЦМВ по сравнению с другими вирусами являются:
- Необычайно крупный ДНК-геном (240 тыс. пар нуклеиновых оснований), а также cинтез в процессе жизненного цикла большого числа (до 50) различных вирусных белков.
- Широкий спектр путей инфицирования: воздушно-капельный, урогенитальный, внутриутробный, постнатальный, а также через компоненты крови при переливаниях и пересадке органов.
- Возможность инфицирования широкого круга органов и тканей, включая клетки нервной ткани, костного мозга, лимфоузлов, печени, легких, ЖКТ, гениталий, клеток крови.
- Способность после первичного инфицирования переходить в латентную стадию инфекции с последующей возможной реактивацией при состояниях, связанных с иммунной супрессией.
Жизненный цикл ЦМВ является сложным многоступенчатым процессом. ДНК вируса становится транскрипционно активной только при проникновении в ядро клетки. В первую очередь происходит транскрипция предранних генов (IE) и синтез соответствующих им белков, обладающих регуляторными функциями дальнейшей экспрессии вирусного генома. Далее синтезируются белки ранних (Е) генов, которые, как полагают, играют важную роль в репликации вирусной ДНК. Наконец, поздние (L) белки, большая часть которых представлена структурными полипептидами, образуются при наличии вновь синтезируемого вирусного генома и ранних белков.
Распространенность ЦМВ
Число серопозитивных среди лиц старше 30 лет составляет 60-100 % в зависимости от региона и социально-экономических условий жизни. У иммунокомпетентных лиц ЦМВИ обычно протекает бессимптомно или вызывает самокупирующийся мононуклеоз, который также наблюдается иногда при реактивации латентного вируса. У пациентов с ослабленной иммунной системой ЦМВ часто является причиной разнообразных заболеваний: мононуклеоза, хориоретинита, пневмонии, гепатита и др., а также нарушений психо-моторного развития и умственной отсталости у детей.
ЦМВИ у детей
ЦМВ является наиболее частой причиной внутриутробной инфекции. У серопозитивных женщин поражение плода ЦМВ может происходить в результате реактивации вируса или вторичного инфицирования во время беременности. Первичная ЦМВИ у беременных возникает значительно реже, чем реактивация латентной инфекции, но представляет повышенную опасность, т.к. сопровождается 50 %-ным риском ЦМВИ плода и новорожденного. Инфицирование плода может вызвать нарушение функциональных механизмов дифференцировки клеток и тканей органов. Наиболее высока чувствительность плода к ЦМВ на ранних стадиях внутриутробного развития (вирус размножается более интенсивно в клетках с высоким уровнем метаболизма).
Около 2 % новорожденных инфицируется ЦМВ в период внтриутробного развития, и из них до 10 % погибают в течение года. 10-60 % детей заражаются при прохождении через родовые пути и в первые 6 месяцев жизни через грудное молоко.
Клинические проявления ЦМВИ у новорожденных могут включать желтуху, пневмонию, кахексию, микроцефалию, хориоретинит, гастроэнтерит, задержку умственного развития, глухоту, патологии сердца, печени и др.
ЦМВ — этиологический агент ряда заболеваний
- При переливании больших объемов крови и ее компонентов может наблюдаться постперфузионный синдром, обусловленный первичным инфицированием ЦМВ или его реактивацией.
- Установлена связь ЦМВИ с развитием диабета.
- Известно, что 15-20 % вирусных гепатитов неясной этиологии обусловлено поражением печени ЦМВ. Кроме того, показано, что продукты IE-генов ЦМВ способны трансактивировать экспрессию НВs- и Cor-антигенов ВГВ. Поэтому, ЦМВ, возможно, играет коэтиологическую роль в возникновении карциномы печени.
- ЦМВ поражает многие типы клеток крови и может персистировать в моноцитах, макрофагах, мегакариоцитах, что в ряде случаев приводит к тромбоцитопении.
- Группой наибольшего риска для ЦМВИ являются лица с искусственной или естественной иммунносупрессией — ВИЧ инфицированные, реципиенты органов, тканей, клеток, онкологические больные. Тяжесть и спектр клинических проявлений ЦМВИ у таких пациентов достаточно разнообразны: мононуклеоз, пневмония, хориоретинит, нарушения в ЖКТ, поражения периферической и центральной нервной системы.
Лабораторная диагностика ЦМВИ
Серологический анализ.
Для тестирования сывороток применяют в основном иммуноферментный анализ (ИФА). В качестве антигена обычно используют экстракты лизированных инфицированных вирусом клеток или очищенные вирусные частицы. Поскольку для получения антигена зачастую используют различные штаммы ЦМВ, культивируемые на нескольких типах клеток, а также применяют различные методы выделения антигена, его трудно стандартизировать. В связи с этим результаты анализа одних и тех же образцов различными тест-системами могут значительно отличаться друг от друга. Кроме того, нередко имеют место перекрестные реакции с другими герпесвирусами, обусловленные гомологией ряда белков семейства герпесвирусов. Проблема стандартизации антигена и кросс-реактивности может быть разрешена путем использования хорошо охарактеризованных вирусных белков или их фрагментов, полученных биотехнологическим способом.
- Определение IgG. Позволяет выявить латентную ЦМВИ, а также первичную ЦМВИ или реактивацию вируса при наличии сероконверсии или определении титра антител в динамике. Позволяет установить также группу риска среди беременных женщин (с отсутствием антител к ЦМВ).
- · Определение IgM. Наличие IgM в сыворотке крови может расцениваться как показатель текущей инфекции — первичной или рецидивирующей. Ограничения метода связаны с низким уровнем IgM в тестируемой сыворотке или их возможным отсутствием в случаях рецидивирующей инфекции и у лиц с иммуносупрессией. Возможны ложноположительные результаты, обусловленные наличием ревматоидного фактора класса М.
Имеющаяся иногда несогласованность между параметрами иммунного ответа и клиническими проявлениями накладывает дополнительные ограничения на серологический анализ в диагностике ЦМВИ. Это обусловлено особенностями иммунного ответа при данном заболевании, часто возникающем на фоне иммунодефицитного состояния пациента. Поэтому важную роль в постановке диагноза ЦМВИ играет определение вирусных антигенов и вирусной ДНК.
Определение вирусных антигенов и вирусной ДНК
- Выделение вируса — один из традиционных методов лабораторной диагностики ЦМВИ. Он заключается в культивировании клеток фибробластов, инфицированных биологической жидкостью пациента. Возникшие морфологические изменения клеток указывают на наличие вируса в исследуемом образце. Длительность процесса (3-4 недели), цитотоксичность некоторых образцов (моча, слюна), слабая выраженность морфологических изменений при сопутствующих инфекциях существенно ограничивают использование данного метода. В последнее время он был несколько усовершенствован. За счет использования моноклональных антител (МКА) к белкам ЦМВ и детекции образующихся комплексов с помощью иммунофлуоресценции или пероксидазного окрашивания удалось сократить время анализа и повысить его специфичность.
- Выявление вирусных белков. Производят с использованием реакции цитохимического анализа (иммунофлюоресцентного или иммуноферментного окрашивания образцов клеток пациента, содержащих ЦМВ) или твердофазного ИФА вирусного антигена в клинических образцах. Оба метода основаны на высокоспецифичных МКА к белкам ЦМВ. Основное ограничение методов — в их недостаточной чувствительности.
- Выявление вирусной нуклеиновой кислоты (ДНК). Является прямым подтверждением ЦМВИ и позволяет эффективно контролировать ее лечение. В настоящее время для выявления ДНК ЦМВ используют следующие подходы:
- — Дот-гибридизация. Для иммобилизации ДНК из клинических образцов используют нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры, а в качестве зонда при гибридизации — специфические фрагменты ДНК ЦМВ, меченные в различных вариантах анализа — фосфором-32, биотином, диоксигенином и др. Метод высоко специфичен, однако недостаточно чувствителен. Например, при использовании биотинилированного зонда и конъюгированного со щелочной фосфатазой стрептавидина для получения положительного сигнала необходимо наличие в исследуемой пробе 5×105-106 вирусных геномов.
- — Гибридизация in situ. Определение ДНК ЦМВ методом гибридизации в цитологических препаратах, также характеризуется недостаточной чувствительностью.
- — Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время является наиболее чувствительным. Метод ПЦР основан на специфическом взаимодействии синтетических олигонуклеотидов (праймеров) с ДНК ЦМВ и последующем синтезе ее специфического участка с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. В результате многократного повторения циклов денатурации ДНК, сплавления (отжига) с исследуемой ДНК праймеров и синтеза с них комплементарных цепей ДНК, концентрация синтезированного фрагмента ДНК в исследуемой пробе увеличивается в геометрической прогрессии. Это позволяет выявлять ДНК с высокой чувствительностью — 10-100 геномов ДНК ЦМВ на исследуемую пробу. За рубежом метод ПЦР давно и успешно используется как для диагностики, так и для контроля за терапией целого ряда инфекций вирусной и бактериальной этиологии, в том числе и ЦМВИ.
Сложность развития ЦМВИ, часто протекающей на фоне иммунодепрессивного состояния, с наличием первичной, латентной и рецидивирующей инфекций, имеющимися фактами несогласованности между параметрами иммунного ответа и клиническими проявлениями позволяет ставить окончательный диагноз только по совокупности результатов лабораторной диагностики (IgG, IgM, ДНК, вирусные антигены), клинических наблюдений и эпидемиологии
Источник: Цитомегаловирусная инфекция и ее лабораторная диагностика М.П. Гришаев, заведующий лабораторией зондового анализа
